Apa itu Sulforaphane?

Sulforaphane adalah fitokimia, zat dalam kelompok isothiocyanate senyawa organosulfur, ditemukan dalam sayuran silangan, seperti brokoli, kubis, kembang kol, dan kubis Brussel. Ini juga dapat ditemukan di bok choy, kale, sawi, sawi dan selada air. Studi penelitian menunjukkan bahwa sulforaphane dapat membantu mencegah berbagai jenis kanker mengaktifkan produksi Nrf2, atau faktor nuklir terkait eritroid 2, faktor transkripsi yang mengatur mekanisme antioksidan protektif yang mengontrol respons sel terhadap oksidan. Tujuan artikel berikut ini adalah untuk menjelaskan fungsi sulforaphane.

Abstrak

Sistem antioksidan KEAP1-Nrf2-ARE adalah sarana utama dimana sel-sel merespon terhadap tekanan oksidatif dan xenobiotik. Sulforaphane (SFN), isothiocyanate elektrofilik yang berasal dari sayuran silangan, mengaktifkan jalur KEAP1-Nrf2-ARE dan telah menjadi molekul yang menarik dalam pengobatan penyakit di mana stres oksidatif kronis memainkan peran etiologi utama. Kami menunjukkan di sini bahwa mitokondria dari pigmen retina pigmen manusia (RPE-1) yang diobati dengan SFN mengalami hiperfusi yang independen dari Nrf2 dan inhibitor sitoplasmik KEAP1. Fusi mitokondria telah dilaporkan menjadi sitoprotektif dengan menghambat pembentukan pori di mitokondria selama apoptosis, dan konsisten dengan ini, kami menunjukkan Nrf2-independen, sitoproteksi sel-sel yang diobati dengan SFN yang terpapar pada inducer apoptosis, staurosporine. Secara mekanis, SFN mengurangi perekrutan dan / atau retensi faktor fisi terlarut Drp1 ke mitokondria dan peroksisom tetapi tidak mempengaruhi kelimpahan Drp1 secara keseluruhan. Data ini menunjukkan bahwa sifat menguntungkan dari SFN melampaui aktivasi sistem KEAP1-Nrf2-ARE dan menjamin interogasi lebih lanjut mengingat penggunaan saat ini agen ini dalam beberapa uji klinis.

Kata kunci: Sulforaphane, Nrf2, Drp1, Mitochondria, Fission, Fusion, Apoptosis

Pengantar

Sulforaphane adalah Nrf2-Independent Inhibitor dari Mitochondrial Fission

Sulforaphane (SFN) adalah senyawa isothiocyanate yang berasal dari makanan yang paling umum dari sayuran silangan [56]. Ini dihasilkan pada tanaman sebagai respon xenobiotik terhadap predasi melalui pelepasan vesikular myosinase enzim hidrolitik dari sel yang rusak; enzim ini mengubah glukosinolat menjadi isothiocyantes [42]. Selama dua dekade terakhir, SFN telah secara ekstensif dicirikan untuk sifat antikanker, antioksidan, dan antimikrobanya yang dilaporkan [57]. Sebagian besar kemanjuran ini telah dikaitkan dengan kapasitas SFN untuk memodulasi jalur sinyal penandaan KEAP1-Nrf2-antioxidant element (ARE), meskipun aktivitas tambahan dari senyawa telah diidentifikasi, termasuk penghambatan aktivitas histone deacetylase dan perkembangan siklus sel [ 29]. Nrf2 adalah faktor transkripsi antioksidan utama dan dalam kondisi homeostasis, stabilitasnya ditekan melalui aksi cytoplasmic Cullin3KEAP1 ubiquitin ligase complex [20]. Secara khusus, Nrf2 direkrut ke Cullin3KEAP1 ligase dengan mengikat ke adaptor substrat dimeric KEAP1 dan kemudian dimodifikasi dengan rantai polyub yang menargetkan faktor transkripsi untuk degradasi berperantara proteasome. Omzet konstitutif ini membatasi waktu paruh Nrf2 dalam sel tanpa tekanan hingga ~ 15 menit [30], [33], [46], [55]. Menanggapi berbagai jenis stres, terutama stres oksidatif, KEAP1, protein yang kaya sistein, bertindak sebagai sensor redoks, dan modifikasi oksidatif sistein penting, terutama C151, KEAP1 memisahkan Nrf2-KEAP1 dari CUL3 sehingga mencegah degradasi Nrf2 [ 8], [20], [55]. Khususnya, SFN, dan mungkin aktivator Nrf2 lainnya, meniru stres oksidatif dengan memodifikasi C151 dari KEAP1 misalnya [21]. Stabilisasi Nrf2 memungkinkan translokasi ke nukleus di mana ia menginduksi ekspresi baterai dari antioksidan fase II dan gen detoksifikasi. Nrf2 berikatan dengan elemen promotor respon antioksidan (ARE) dari gen targetnya yang diwaspadai melalui heterodimerisasi dengan protein Maf kecil [19]. Sistem ini menyajikan respon yang dinamis dan sensitif terhadap antioksidan tidak langsung seperti SFN, radikal bebas yang dihasilkan oleh mitokondria [16], atau sumber fisiologis lain dari stres oksidatif [41].

Mitokondria adalah organel subselular yang dinamis yang mengatur sejumlah fungsi seluler mulai dari produksi ATP dan buffer kalsium intraseluler hingga regulasi redoks dan apoptosis [13], [49]. Mitokondria juga merupakan sumber utama spesies oksigen reaktif (ROS) di dalam sel. Pengaturan yang tepat dari fungsi mitokondria karena itu diperlukan untuk mengoptimalkan produksi ATP untuk memenuhi kebutuhan seluler sambil meminimalkan efek yang berpotensi membahayakan dari produksi radikal bebas yang berlebihan. Persyaratan penting untuk modulasi halus fungsi mitokondria adalah kapasitas mitokondria berfungsi baik secara independen sebagai mesin biokimia dan sebagai bagian dari jaringan yang luas dan responsif.

Morfologi dan fungsi mitokondria ditentukan oleh keseimbangan yang diatur antara fisi dan fusi. Fisi mitokondria diperlukan untuk mewarisi sel anak mitokondria selama pembelahan sel [28] serta untuk degradasi, selektif, autophagic dari depolarized atau kerusakan mitokondria, disebut mitophagy [1]. Sebaliknya, fusi diperlukan untuk melengkapi genom mitokondria dan berbagi komponen rantai transpor elektron antara mitokondria yang berdekatan [54]. Pada tingkat molekuler, fisi dan fusi mitokondria diatur oleh GTPase besar yang menyerupai dynamin. Tiga enzim terutama mengatur fusi: Mitofusins ​​1 dan 2 (Mfn1 / 2) adalah protein membran luar dua-pass yang memediasi fusi membran luar melalui interaksi heterotypic antara mitokondria yang berdekatan [15], [25], [37], sementara OPA1 adalah bagian dalam protein membran yang secara bersamaan memastikan konektivitas matriks dengan mengatur penyatuan membran bagian dalam [5]. Aktivitas GTPase dari ketiga protein diperlukan untuk fusi kuat [5], [18], dan OPA1 lebih lanjut diatur oleh proteolisis kompleks dalam membran dalam mitokondria oleh protease OMA1 [14], PARL [6], dan YME1L [45 ]. Yang penting, potensi membran mitokondria yang utuh diperlukan untuk penggabungan yang efisien untuk menekan integrasi mitokondria yang rusak dan sehat [26].

Fisi mitokondria terutama dikatalisasi oleh protein sitosol yang disebut protein yang terkait dengan Dynamo 1 (Drp1 / DNM1L). Drp1 direkrut dari sitosol ke situs prospektif fisi pada membran luar mitokondria [43]. Reseptor utama untuk Drp1 pada membran luar adalah faktor fisi mitokondria (Mff) [32] dan, pada tingkat lebih rendah, Fisi 1 (Fis1) [51]. Selain itu, reseptor umpan, MIEF1 / MiD51, ditemukan yang bertindak untuk lebih membatasi aktivitas protein Drp1 di situs fisi potensial [58]. Setelah berlabuh di membran luar mitokondria, Drp1 oligomerizes ke dalam struktur seperti spiral di sekitar tubuh mitokondria dan kemudian memanfaatkan energi yang berasal dari hidrolisis GTP untuk memediasi pencabutan fisik membran luar dan dalam mitokondria [17]. Endoplasmic-derived tubules bertindak sebagai pembatas awal mitokondria sebelum oligomerisasi Drp1, menggarisbawahi wahyu bahwa mitokondria non-terbatas lebih lebar daripada lingkar permisif dari spiral Drp1 yang lengkap [12]. Dinamika aktin juga penting untuk interaksi ER-mitokondria yang mendahului fisi mitokondria [24]. Selain perannya dalam fisi mitokondria, Drp1 mengkatalisis fisi peroksisom [40].

Drp1 sangat mirip dengan protein dynamin berkarakter baik dalam kedua protein yang mengandung domain GTPase N-terminal, domain menengah yang penting untuk self-oligomerization, dan domain efektor GTPase C-terminal [31]. Drp1 mencapai selektivitas untuk membran mitokondria melalui kombinasi interaksi dengan protein reseptornya Mff dan Fis1 dan juga melalui afinitasnya untuk kardiolipin fosfolipid mitokondria spesifik melalui domain B-insert unik dari Drp1 [2]. Drp1 biasanya ada sebagai homotetramer di sitoplasma, dan susunan urutan yang lebih tinggi di situs fisi mitokondria diperantarai oleh domain Tengah Drp1 [3].

Mengingat hubungan implisit antara fungsi mitokondria dan jalur KEAP1-Nrf2-ARE, kami menyelidiki efek aktivasi Nrf2 pada struktur dan fungsi mitokondria. Kami menunjukkan di sini bahwa SFN menginduksi hyperfusion mitokondria yang, tanpa diduga, tidak bergantung pada Nrf2 dan KEAP1. Efek dari SFN ini adalah melalui penghambatan fungsi Drp1. Kami lebih lanjut menunjukkan bahwa SFN memberikan resistansi terhadap apoptosis yang Nrf2-independen dan meniru yang diamati dalam sel-sel habis Drp1. Data ini secara kolektif menunjukkan bahwa selain menstabilkan dan mengaktifkan Nrf2, SFN memodulasi dinamika mitokondria dan mempertahankan kebugaran dan kelangsungan seluler.

Hasil

Sulforaphane Menginduksi Nrf2 / KEAP1-Independent Hyperfusion of Mitochondria

Dalam proses mempelajari efek aktivasi Nrf2 pada dinamika jaringan mitokondria, kami menemukan bahwa pengobatan sel epitel pigmen retina manusia (RPE-1) yang diabadikan dengan sulforaphane (SFN), aktivator kuat pensinyalan Nrf2, menyebabkan fusi kuat dari jaringan mitokondria jika dibandingkan dengan sel kontrol yang dirawat oleh kendaraan (Gambar 1A dan B). Morfologi mitokondria dalam sel-sel ini sangat mirip dengan mitokondria dalam sel yang dikosongkan oleh siRNA dari Drp1 endogen, faktor fisi mitokondria utama (Gbr. 1A). Hasil ini memunculkan gagasan yang menarik bahwa fisi mitokondria dan status fusi merespon langsung ke tingkat Nrf2 dalam sel. Namun, stimulasi sel dengan penstabil Nrf2 dan aktivator lain seperti proteasome inhibitor MG132, pro-oxidant tBHQ, atau knockdown dari Nrf2 inhibitor KEAP1 tidak menyebabkan fusi mitokondria (Gbr. 1A dan B). Stabilisasi Nrf2 dengan manipulasi ini dikonfirmasi oleh western blotting untuk Nrf2 endogen (Gbr. 1C). Lebih lanjut, ekspresi Nrf2 dapat disalurkan untuk fusi mitokondria yang diinduksi SFN, karena knockdown Nrf2 endogen dengan siRNA gagal untuk melawan fenotipe ini (Gbr. 1D F). Karena SFN menstimulasi jalur KEAP1-Nrf2-ARE dengan memodifikasi residu sistein KEAP1 secara kovalen [21], kami merobohkan KEAP1 untuk mengetahui apakah hiperfusi mitokondria yang diinduksi SFN distimulasi melalui jalur bergantung KEAP1, tetapi jalur independen Nrf2. Namun, penipisan KEAP1 juga gagal untuk membatalkan fusi mitokondria yang diinduksi SFN (Gbr. 1G I). Faktanya, SFN membalikkan morfologi pro-fisi yang disebabkan oleh penipisan KEAP1 (Gbr. 1G, panel b versus panel d). Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan SFN menyebabkan fusi mitokondria tidak bergantung pada jalur KEAP1-Nrf2-ARE kanonik dan mengarahkan kami untuk menginterogasi apakah SFN secara langsung mempengaruhi komponen fisi mitokondria atau mesin fusi.

Sulforaphane merusak Asosiasi Mitokondria Drp1

Berdasarkan temuan bahwa pengobatan SFN menginduksi hiperfusi mitokondria, kami beralasan bahwa fenotip ini merupakan konsekuensi dari aktivitas fusi berlebihan atau penghambatan aktivitas fisi. Untuk membedakan antara dua kemungkinan ini, kami membandingkan morfologi peroksisom di hadapan dan tidak adanya SFN. Peroksisom mirip dengan mitokondria karena mereka adalah organel yang dinamis bentuk dan panjangnya yang terus-menerus berubah [44]. Peroksisom mengandung Fis1 dan Mff di membran luarnya dan, sebagai konsekuensinya, adalah target untuk fisi yang dimediasi Drp1 [22], [23]. Namun, peroksisom tidak menggunakan mesin fusi jaringan mitokondria dan akibatnya, tidak mengalami fusi [39]. Sebaliknya, fisi peroxisomal ditentang oleh pemanjangan peroxisomes yang ada melalui de novo penambahan membran dan protein [44]. Karena peroxisomes tidak memiliki Mfn1 / 2 dan OPA1, kami beralasan bahwa jika SFN mengaktifkan fusion machinery daripada menghambat mesin fisi, panjang peroxisome tidak akan terpengaruh. Dalam sel yang diperlakukan dengan kendaraan, peroksisom dipertahankan sebagai organel pendek, bulat, dan beraksis (Gambar 2, panel b dan d). Namun, pengobatan SFN meningkatkan panjang peroksisom oleh ~ 2-fold dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar. 2, panel f dan h). Selanjutnya, banyak peroksisom yang terjepit di dekat pusat, menunjukkan cacat scission potensial (Gambar. 2, panel h, kepala panah). Demikian pula, peroksisom dalam sel yang ditransfeksikan dengan SiRNA SiOpalnya sangat panjang (Gambar 1, panel j dan l), yang menegaskan bahwa Drp2 diperlukan untuk fisi peroksisomal dan menyarankan bahwa pengobatan SFN menyebabkan fenotip mitokondria dan peroksisom dengan mengganggu mesin fisi.

Kami selanjutnya menentukan bagaimana SFN membatasi fungsi Drp1. Kemungkinan termasuk pengurangan tingkat ekspresi, rekrutmen / retensi di mitokondria, oligomerisasi, atau aktivitas enzimatik GTPase. Defisit pada salah satu dari ini akan menghasilkan pengurangan fisi mitokondria dan hiperfusi. Kami tidak mendeteksi perubahan yang dapat direproduksi dalam kadar protein Drp1 setelah pengobatan SFN (Gbr. 1C dan 3A), dan oleh karena itu menyimpulkan bahwa SFN tidak mengubah stabilitas atau ekspresi Drp1, konsisten dengan Drp1 yang memiliki waktu paruh >10 jam [50] dan perawatan SFN kami memiliki durasi yang lebih pendek. Selanjutnya, kami menyelidiki apakah SFN memengaruhi perekrutan atau retensi Drp1 ke mitokondria. Studi fraksinasi menunjukkan bahwa SFN menginduksi hilangnya Drp1 dari fraksi mitokondria (Gbr. 3A, jalur 7-8 dan Gbr. 3B). Seperti dilaporkan sebelumnya [43], hanya sebagian kecil dari Drp1 (~3%) dikaitkan dengan jaringan mitokondria pada waktu tertentu selama kondisi mapan dengan sebagian besar enzim berada di sitoplasma (Gbr. 3A, jalur 5-8 ). Data fraksinasi ini dikonfirmasi menggunakan analisis co-localization yang menunjukkan penurunan ~40% pada fokus Drp1 yang terlokalisasi di mitokondria setelah perawatan SFN (Gbr. 3C dan D). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa fusi mitokondria yang diinduksi oleh SFN, setidaknya sebagian, disebabkan oleh hubungan Drp1 yang dilemahkan dengan mitokondria. Data kami tidak membedakan antara apakah SFN mengganggu perekrutan mitokondria versus retensi mitokondria Drp1, atau keduanya, karena analisis Drp1 endogen tidak dapat menerima visualisasi GTPase dengan mikroskop sel hidup.

Sulforaphane Menyampaikan Perlindungan Terhadap Staurosportine-Induced Apoptosis Independen Nrf2

Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa pembelahan mitokondria permisif dalam pembentukan pori-pori di membran luar mitokondria yang dihasilkan oleh Bax/Bak selama apoptosis [11]. Drp1 telah terbukti direkrut secara selektif ke mitokondria selama apoptosis [11] dan, konsisten dengan ini, mitokondria yang terfragmentasi telah diamati di awal proses [27]. Sebaliknya, menghambat pembelahan mitokondria diduga menghambat apoptosis dengan menghalangi pembentukan pori-pori membran luar yang memungkinkan pelepasan sitokrom c [53]. Dengan demikian, merangsang fusi mitokondria menunda perkembangan apoptosis yang disebabkan oleh senyawa termasuk staurosporin (STS) [14]. Untuk menentukan apakah SFN melindungi sel RPE-1 dari apoptosis yang dimediasi STS dan jika demikian, apakah ini memerlukan Nrf2, kami membuat pengujian untuk dengan mudah menginduksi pembelahan poli ADP ribosa polimerase (PARP), substrat caspase-3 yang diaktifkan dan penanda definitif dari apoptosis. Pengobatan sel RPE-1 dengan 1 M STS selama 6 jam hanya menyebabkan pembelahan PARP yang sangat sederhana namun ini dicegah oleh pengobatan bersama SFN (misalnya, Gambar 4A, jalur 3 versus 4). Untuk meningkatkan kekokohan pengujian ini, kami selanjutnya membuat sel peka terhadap apoptosis yang diinduksi STS dengan pra-perawatan mereka dengan siRNA yang menargetkan faktor anti-apoptosis, Bcl-XL. Pretreatment ini mengurangi ekspresi Bcl-XL dan secara nyata mempromosikan pembelahan PARP sebagai fungsi waktu yang terpapar STS (Gbr. 4B, bandingkan jalur 2 dengan jalur 4-10). Yang penting, 2 jam pra-perawatan dengan SFN mengurangi pembelahan PARP dalam sel yang terpapar STS (Gbr. 4C, jalur 3 versus 4 dan jalur 5 versus 6). Demikian juga, sel-sel yang secara stabil kehabisan Nrf2 oleh CRISPR/Cas9 dilindungi secara sebanding dari toksisitas STS oleh pra-perawatan SFN (Gbr. 4C, jalur 11 versus 12 dan jalur 13 versus 14 dan Gambar. 4D). Perlindungan ini diamati menggunakan pembelahan PARP (Gbr. 4C dan D) dan morfologi seluler (Gbr. 4E) sebagai pembacaan. Kemanjuran penipisan Nrf2 oleh CRISPR/Cas9 dikonfirmasi oleh western blotting (Gbr. 4C, Nrf2 blot). Seperti yang diperkirakan, menipisnya sel Drp1, yang juga menghasilkan fenotipe hiperfusi (Gbr. 1A), juga memblokir pembelahan PARP sebagai respons terhadap STS dibandingkan dengan sel kontrol yang diinkubasi dengan SFN (Gbr. 4F dan G). Bersama-sama, temuan ini konsisten dengan SFN yang memberikan perlindungan terhadap apoptosis melalui kapasitasnya untuk membatasi fungsi Drp1, terlepas dari stabilisasi dan aktivasi Nrf2.

Diskusi

Kami telah menemukan bahwa SFN memodulasi mitokondria fisi / fusi dinamika independen dari efeknya pada jalur KEAP1-Nrf2-ARE. Ini menarik karena diasumsikan hubungan antara disfungsi mitokondria dan produksi ROS dan perlunya memadamkan mitokondria yang diturunkan dari mitokondria melalui aktivasi Nrf2. Ini dampak fungsional tambahan dari SFN adalah potensi penting mengingat lebih dari uji klinis 30 saat ini sedang menguji SFN untuk pengobatan berbagai penyakit termasuk kanker prostat, penyakit paru obstruktif, dan penyakit sel sabit [7], [10], [ 47].

Karena SFN adalah isothiocyanate [56] dan mengaktivasi pensinyalan Nrf2 dengan langsung meng-asilasikan cysteines KEAP1 kritis untuk menekan degradasi Nrf2 [21], maka SFN memberikan efek pro-fusi dengan memodulasi aktivitas faktor fisi atau fusi melalui modifikasi sistein. . Data kami sangat mendukung Drp1 yang secara negatif diatur oleh SFN meskipun apakah GTPase adalah target langsung dari asilasi masih harus dijelaskan. Meskipun kesenjangan pengetahuan ini, fungsi Drp1 jelas dikompromikan oleh SFN sebagai mitokondria dan peroksisom menjadi hiperfusi dalam menanggapi pengobatan SFN dan organel ini berbagi Drp1 untuk masing-masing peristiwa pengerutan [38]. Selain itu, SFN menurunkan jumlah Drp1 yang melokalisasi dan terakumulasi pada mitokondria (Gbr. 3). Karena percobaan kami dilakukan dengan semua protein endogen, deteksi kami terhadap Drp1 di situs fisi mitokondria berada dalam kondisi steady-state, dan akibatnya, kami tidak dapat membedakan antara rekrutmen versus retensi retensi enzim yang disebabkan oleh SFN. Lebih lanjut, kami tidak dapat menghilangkan kemungkinan bahwa SFN mengakumulasi reseptor di mitokondria (Fis1 atau Mff) untuk memblokir perekrutan Drp1, kami menduga bahwa Drp1 secara langsung dimodifikasi. Drp1 memiliki sembilan cysteines, delapan di antaranya berada dalam Domain Tengah yang diperlukan untuk oligomerisasi [3], dan salah satunya berada di Domain GTPase Effector (GED) di C-terminus Drp1. Asilasi langsung dari salah satu sistein ini dapat menyebabkan cacat aktivitas pada Drp1 dan oleh karena itu mendasari efek SFN pada dinamika mitokondria. Khususnya, pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa cacat dalam oligomerisasi dan aktivitas katalitik dapat membatalkan retensi Drp1 di mitokondria [52]. Cys644 di domain GED adalah target yang sangat menarik berdasarkan pada karya sebelumnya yang menunjukkan bahwa mutasi dari mutasi phenocopies sistein yang mengganggu aktivitas Drp1 GTPase [4] dan bahwa sistein khusus ini dimodifikasi oleh elektrofil tiol-reaktif [9]. Resolusi pertanyaan luar biasa ini akan membutuhkan validasi spektrometri massa. Singkatnya, kami telah mengidentifikasi sebuah novel, fungsi cytoprotective untuk SFN senyawa yang relevan secara klinis. Selain mengaktifkan faktor transkripsi anti-oksidan master Nrf2, SFN mempromosikan fusi mitokondria dan peroxisomal, dan efek ini tidak bergantung pada Nrf2. Mekanisme yang mendasari fenomena ini melibatkan pengurangan fungsi GTPase Drp1, mediator utama dari fisi mitokondria dan peroksisomal. Konsekuensi utama dari fusi mitokondria yang dimediasi oleh SFN adalah bahwa sel menjadi resisten terhadap efek racun dari staurosporine inducer apoptosis. Ini tindakan cytoprotective tambahan dari SFN bisa menjadi utilitas klinis tertentu dalam berbagai penyakit neurodegeneratif yang usia adalah faktor risiko utama (misalnya, Penyakit Parkinson, Penyakit Alzheimer, Degenerasi Makula Terkait Usia) karena penyakit ini telah dikaitkan dengan apoptosis dan berkurang. tingkat dan / atau disregulasi Nrf2 [35], [36], [48].

Bahan dan Metode

Tes Apoptosis

Sel diunggulkan dan ditransfeksi dengan siRNA seperti yang ditunjukkan di bawah ini. Sel-sel tersebut diberi perlakuan sebelumnya dengan 50? M sulforaphane selama 2 jam untuk menginduksi fusi mitokondria dan kemudian dirawat dengan 1? M staurosporine untuk menginduksi apoptosis. Pada saat panen, media dikumpulkan dalam tabung individu dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi ke sel apoptosis pelet. Pelet sel ini digabungkan dengan sel yang melekat dan dilarutkan dalam buffer Laemmli pekat 2 kali. Sampel menjadi sasaran anti-PARP western blotting.

Pembangun Generasi CRISPR / Cas9

Untuk membuat LentiCRISPR / eCas9 1.1, LentiCRISPR v2 (addgene #52961) pertama kali dipotong dengan Age1 dan BamH1. Selanjutnya, SpCas9 dari eSpCas9 1.1 (addgene #71814) adalah PCR yang diperkuat dengan Age1 dan BamH1 overhang menggunakan primer berikut (Maju AGCGCACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC, Reverse AAGCGCGGATCCCTTTTCTTTTTGGTGGCCGG) dan ligated ke vektor cut di atas. Urutan sgRNA ditentukan dengan menggunakan Benchling.com. Parameter ditetapkan untuk menargetkan urutan pengkodean dengan skor tertinggi di sasaran dan terendah di luar target. Berikut urutan (menargetkan urut digarisbawahi, hs sgNFE2L2 # 1 rasa CACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC, antisense AAACGCTCATACTCTTTCCGTCGC; hs sgNFE2L2 # 2 rasa CACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT, antisense AAACAGCACATCCAGTCAGAAACC; hs sgNFE2L2 # 3 rasa CACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC, antisense AAACGTGGATCTGCCAACTACTCC) dikeraskan dan diikat ke BsmB1 memotong LentiCRISPR / eCas9 1.1. Sel RPE-1 yang terinfeksi secara renal dipilih dengan puromisin dan dipertahankan sebagai populasi yang dikumpulkan. Knockout dikonfirmasi oleh imunofluoresensi dan western blotting.

Budaya Sel dan Transfeksi

Sel epitel pigmen retina manusia yang ditransformasikan dengan telomerase (RPE-1) (ATCC) dibiakkan di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) yang mengandung glukosa 1 g / L yang dilengkapi dengan penisilin, streptomisin, 1X koktail asam amino non-esensial (Life Technologies), dan 10% Serum Sapi Janin (Teknologi Kehidupan). Untuk transfeksi siRNA, 30,000 - 35,000 sel / mL disemai semalaman. Sel menerima 10 nM siRNA yang diencerkan dalam DMEM bebas serum dan dikombinasikan dengan 0.3% reagen transfeksi interferin (PolyPlus). Untuk sensitisasi apoptosis, sel menerima 1 nM Bcl-XL siRNA. Sel dipanen 2 3 hari pasca transfeksi.

Bahan kimia, Antibodi, dan siRNA Oligos

Antibodi terhadap? -Tubulin (Cell Signaling),? -Tubulin (Sigma), Drp1 (BD Biosciences), KEAP1 (Proteintech), Lamin B1 (Abcam), PARP (Cell Signaling), PMP70 (Abcam), dan Tom20 (BD Biosciences ) digunakan pada pengenceran 1: 1000 untuk western blotting dan untuk imunofluoresensi. Di rumah, antibodi kelinci anti-Nrf2 digunakan pada 1: 2000 untuk western blotting [34], [59]. Sulforaphane (Sigma) dan staurosporine (Tocris) digunakan masing-masing pada 50? M dan 1? M. siRNA terhadap Drp1 (Dharmacon), Nrf2 (Dharmacon), KEAP1 (Cell Signaling), dan Bcl-XL (Cell Signaling) digunakan pada 10 nM kecuali dinyatakan lain.

Immunofluorescence dan di Vivo Labeling

Sel yang ditanam pada kaca penutup kaca 18 mm diolah dengan kendaraan atau obat, difiksasi dalam 3.7% formaldehida dan kemudian diserap dalam 0.2% Triton X-100 / PBS di atas es selama 10 menit. Antibodi primer diinkubasi dalam 3% bovine serum albumin (BSA) di PBS semalaman pada suhu 4 ° C. Setelah pencucian PBS, sel diinkubasi selama 1 jam sesuai spesies, Alexa488- atau Alexa546-, antibodi sekunder terkonjugasi (diencerkan 1: 1000) dan 0.1? G / mL DAPI (Sigma) dalam 3% BSA / PBS. Mitokondria divisualisasikan baik dengan imunofluoresensi anti-Tom20 atau dengan menginkubasi sel dalam 200 nM MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Inc.) dalam DMEM bebas serum selama 30 menit pada suhu 37 ° C sebelum fiksasi.

Mikroskopi dan Analisis Gambar

Sampel imunofluoresensi dilihat pada mikroskop Confocal LSM710 (Carl Zeiss). Mikrograf ditangkap menggunakan 63X atau 100X oil immersion tujuan dan gambar disesuaikan dan ditingkatkan menggunakan Adobe Photoshop CS6. Analisis ko-lokalisasi dilakukan menggunakan fitur ko-lokalisasi Carl Zeiss LSM710 dengan ambang batas yang ditetapkan secara manual sambil tidak mengetahui identitas sampel. Batang skala keseluruhan, kecuali dinyatakan lain, adalah 10 m. Morfologi mitokondria dinilai dengan skor buta. Jika mitokondria sel dipertahankan sebagai puncta ganda, bulat, diskriminatif, sel diberi skor sebagai fisi . Jika mitokondria individu tidak dapat dibedakan dan seluruh jaringan mitokondria muncul terus menerus, sel dinilai sebagai fusi. Semua sel lain, termasuk yang memiliki mitokondria pengelompokan, diberi skor sebagai 'menengah'.

Fraksinasi subselular

Sel RPE-1 ditumbuhkan untuk pertemuan. Setelah pencucian PBS, sel menjadi sasaran sentrifugasi pada 600 g selama 10 menit dan disuspensi kembali dalam buffer isolasi 600? L (210 mM Mannitol, 70 mM Sukrosa, 5 mM MOPS, 1 mM EDTA pH 7.4 + 1 mM PMSF). Suspensi dilapisi 30 kali dalam homogenizer Dounce. Sebagian kecil homogenat diawetkan sebagai 'lisat sel utuh'. Sisanya disentrifugasi pada 800 g selama 10 menit ke inti pelet. Supernatan dilakukan sentrifugasi pada 1500 g selama 10 menit untuk membersihkan inti yang tersisa dan sel yang tidak terurai. Supernatan ini dilakukan sentrifugasi pada 15,000 g selama 15 menit ke mitokondria pelet. Supernatan diawetkan sebagai fraksi sitosolik . Pellet dicuci dengan lembut dengan PBS dan disuspensi kembali dalam buffer isolasi. Konsentrasi protein dari setiap fraksi diukur dengan uji asam bikinchoninic (BCA) dan jumlah protein yang setara diselesaikan dengan SDS-PAGE.

Western Blotting

Sel dicuci dalam PBS dan dilarutkan dalam 2 kali buffer pelarut Laemmli pekat (100 mM Tris [pH 6.8], 2% SDS, 0.008% bromofenol biru, 2% 2-merkaptoetanol, 26.3% gliserol, dan 0.001% Pyrinin Y). Lisat direbus selama 5 menit sebelum dimuat pada gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat (SDS). Protein dipindahkan ke membran nitroselulosa dan membran diblokir selama 1 jam dalam 5% Susu/TBST. Antibodi primer diencerkan dalam 5% Susu/TBST dan diinkubasi dengan blot semalaman pada suhu 4 C. Antibodi sekunder terkonjugasi lobak peroksidase (HRP) diencerkan dalam 5% Susu/TBST. Bercak diproses dengan chemiluminescence yang ditingkatkan dan kuantifikasi densitometrik dilakukan menggunakan perangkat lunak ImageJ.

Sulforaphane adalah bahan kimia dari koleksi isothiocyanate dari zat organosulfur yang diperoleh dari sayuran silangan, termasuk brokoli, kubis, kembang kol, kale, dan collard, antara lain. Sulforaphane diproduksi ketika enzim myrosinase mengubah glukoraphanin, glukosinolat, menjadi sulforaphane, juga dikenal sebagai sulforaphane-glucosinolate. Broccoli sprout dan cauliflower memiliki konsentrasi glucoraphanin tertinggi atau prekursor sulforaphane. Studi penelitian telah menunjukkan bahwa sulforaphane meningkatkan kemampuan antioksidan tubuh manusia untuk mencegah berbagai masalah kesehatan. Dr Alex Jimenez DC, CCST Insight

Sulforaphane dan Dampaknya pada Kanker, Kematian, Penuaan, Otak dan Perilaku, Penyakit Jantung & Lainnya

Isothiocyanate adalah beberapa senyawa tanaman yang paling penting yang bisa Anda dapatkan dalam diet Anda. Dalam video ini saya membuat kasus yang paling komprehensif untuk mereka yang pernah dibuat. Rentang perhatian yang pendek? Lewati ke topik favorit Anda dengan mengklik salah satu poin waktu di bawah ini. Garis waktu penuh di bawah ini.

Bagian utama:

• 00: 01: 14 - Kanker dan kematian
• 00: 19: 04 - Penuaan
• 00: 26: 30 - Otak dan perilaku
• 00: 38: 06 - Rekap terakhir
• 00: 40: 27 - Dosis

Lini waktu penuh:

• 00: 00: 34 - Pengantar sulforaphane, fokus utama dari video.
• 00: 01: 14 - konsumsi sayuran Cruciferous dan pengurangan dalam semua penyebab kematian.
• 00: 02: 12 - Risiko kanker prostat.
• 00: 02: 23 - Risiko kanker kandung kemih.
• 00: 02: 34 - Kanker paru-paru berisiko pada perokok.
• 00: 02: 48 - Risiko kanker payudara.
• 00: 03: 13 - Hipotetis: bagaimana jika Anda sudah menderita kanker? (intervensi)
• 00: 03: 35 - Mekanisme yang masuk akal mengemudi kanker dan data asosiatif kematian.
• 00: 04: 38 - Sulforaphane dan kanker.
• 00: 05: 32 - Hewan bukti yang menunjukkan efek kuat dari ekstrak kecambah brokoli pada perkembangan tumor kandung kemih pada tikus.
• 00: 06: 06 - Pengaruh suplementasi langsung sulforaphane pada pasien kanker prostat.
• 00: 07: 09 - Bioakumulasi metabolit isothiocyanate dalam jaringan payudara yang sebenarnya.
• 00: 08: 32 - Penghambatan sel induk kanker payudara.
• 00: 08: 53 - Pelajaran sejarah: brassica ditetapkan memiliki sifat-sifat kesehatan bahkan di Roma kuno.
• 00: 09: 16 - Kemampuan Sulforaphane untuk meningkatkan ekskresi karsinogen (benzena, akrolein).
• 00: 09: 51 - NRF2 sebagai saklar genetik melalui elemen respons antioksidan.
• 00: 10: 10 - Bagaimana aktivasi NRF2 meningkatkan ekskresi karsinogen melalui glutathione-S-conjugates.
• 00: 10: 34 - kubis Brussel meningkatkan glutathione-S-transferase dan mengurangi kerusakan DNA.
• 00: 11: 20 - Broccoli sprout drink meningkatkan ekskresi benzena oleh 61%.
• 00: 13: 31 - Broccoli sprout homogenate meningkatkan enzim antioksidan di saluran napas bagian atas.
• 00: 15: 45 - konsumsi sayuran Cruciferous dan kematian penyakit jantung.
• 00: 16: 55 - Bubuk tunas brokoli meningkatkan lipid darah dan risiko penyakit jantung secara keseluruhan pada penderita diabetes tipe 2.
• 00: 19: 04 - Awal dari bagian penuaan.
• 00: 19: 21 - Diet yang diperkaya Sulforaphane meningkatkan masa hidup kumbang dari 15 ke 30% (dalam kondisi tertentu).
• 00: 20: 34 - Pentingnya peradangan rendah untuk umur panjang.
• 00: 22: 05 - Sayuran dan tunas kecambah brokoli tampaknya mengurangi beragam penanda inflamasi pada manusia.
• 00: 23: 40 - Rekap video pertengahan: kanker, bagian penuaan
• 00: 24: 14 - Studi pada tikus menunjukkan sulforaphane dapat meningkatkan fungsi imun adaptif di usia tua.
• 00: 25: 18 - Sulforaphane meningkatkan pertumbuhan rambut pada model tikus botak. Gambar di 00: 26: 10.
• 00: 26: 30 - Awal dari bagian otak dan perilaku.
• 00: 27: 18 - Pengaruh ekstrak kecambah brokoli pada autisme.
• 00: 27: 48 - Pengaruh glucoraphanin pada skizofrenia.
• 00: 28: 17 - Mulai dari diskusi depresi (mekanisme dan studi yang masuk akal).
• 00: 31: 21 - Studi mouse menggunakan 10 model yang berbeda dari depresi yang diinduksi stres menunjukkan sulforaphane sama efektifnya dengan fluoxetine (prozac).
• 00: 32: 00 - Studi menunjukkan konsumsi langsung glukoraphanin pada tikus juga efektif mencegah depresi dari model stres kekalahan sosial.
• 00: 33: 01 - Awal dari bagian neurodegenerasi.
• 00: 33: 30 - Sulforaphane dan penyakit Alzheimer.
• 00: 33: 44 - Sulforaphane dan penyakit Parkinson.
• 00: 33: 51 - Sulforaphane dan penyakit Hungtington.
• 00: 34: 13 - Sulforaphane meningkatkan protein heat shock.
• 00: 34: 43 - Awal dari bagian cedera otak traumatis.
• 00: 35: 01 - Sulforaphane disuntikkan segera setelah TBI meningkatkan daya ingat (studi pada tikus).
• 00: 35: 55 - Sulforaphane dan plastisitas neuronal.
• 00: 36: 32 - Sulforaphane meningkatkan pembelajaran dalam model diabetes tipe II pada tikus.
• 00: 37: 19 - Sulforaphane dan duchenne muscular dystrophy.
• 00: 37: 44 - Myostatin inhibition dalam sel-sel satelit otot (in vitro).
• 00: 38: 06 - Rekap video-ulang: mortalitas dan kanker, kerusakan DNA, stres oksidatif dan peradangan, ekskresi benzena, penyakit kardiovaskular, diabetes tipe II, efek pada otak (depresi, autisme, skizofrenia, neurodegenerasi), jalur NRF2.
• 00: 40: 27 - Pikiran tentang mencari tahu kecambah brokoli atau sulforaphane.
• 00: 41: 01 - Anekdot saat bertumbuh di rumah.
• 00: 43: 14 - Pada suhu memasak dan aktivitas sulforaphane.
• 00: 43: 45 - Konversi bakteri usus dari sulforaphane dari glucoraphanin.
• 00: 44: 24 - Suplemen bekerja lebih baik ketika dikombinasikan dengan myrosinase aktif dari sayuran.
• 00: 44: 56 - Teknik memasak dan sayuran silangan.
• 00: 46: 06 - Isothiocyanate sebagai goitrogens.

Ucapan Terima Kasih

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

Bagaimana Sulforaphane Diproduksi?

Pemanasan Menurunkan Aktivitas Protein Epithiospecifier dan Meningkatkan Formasi Sulforaphane di Brokoli

Abstrak

Sulforaphane, isothiocyanate dari brokoli, adalah salah satu antikarsinogen turunan makanan yang paling ampuh. Senyawa ini tidak terdapat dalam sayuran utuh, melainkan terbentuk dari prekursor glukosinolatnya, glukoraphanin, oleh aksi mirosinase, suatu enzim tioglukosidase, ketika jaringan brokoli dihancurkan atau dikunyah. Namun, sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa hasil sulforaphane dari glukoraphanin rendah, dan bahwa analog nitril non-bioaktif, sulforaphane nitril, adalah produk hidrolisis utama ketika jaringan tanaman dihancurkan pada suhu kamar. Bukti terbaru menunjukkan bahwa dalam Arabidopsis, pembentukan nitril dari glukosinolat dikendalikan oleh protein peka panas, protein epithiospecifier (ESP), kofaktor non-katalitik myrosinase. Tujuan kami adalah untuk menguji efek pemanasan kuntum dan kecambah brokoli pada pembentukan sulforaphane dan sulforaphane nitril, untuk menentukan apakah brokoli mengandung aktivitas ESP, kemudian mengkorelasikan perubahan yang bergantung pada panas dalam aktivitas ESP, kandungan sulforaphan, dan bioaktivitas, yang diukur dengan induksi fase II enzim detoksifikasi quinone reductase (QR) dalam kultur sel. Pemanasan kuntum brokoli segar atau kecambah brokoli hingga 60 °C sebelum homogenisasi secara bersamaan meningkatkan pembentukan sulforaphane dan menurunkan pembentukan nitril sulforaphan. Hilangnya aktivitas ESP yang signifikan sejalan dengan penurunan pembentukan sulforaphane nitril. Pemanasan hingga 70 °C dan lebih tinggi menurunkan pembentukan kedua produk dalam kuntum brokoli, tetapi tidak pada kecambah brokoli. Induksi QR pada sel hepatoma tikus Hepa lclc7 yang dikultur sejalan dengan peningkatan pembentukan sulforaphane.

Kuntum dan kecambah brokoli yang dipanaskan terlebih dahulu hingga suhu 60 ° C secara signifikan meningkatkan pembentukan sulforaphane (SF) yang dikatalis oleh myrosinase dalam ekstrak jaringan sayuran setelah penghancuran. Hal ini dikaitkan dengan penurunan pembentukan sulforaphane nitrile (SF Nitrile) dan aktivitas epithiospecifier protein (ESP).

Kata kunci: Brokoli, Brassica oleracea, Cruciferae, Kanker, Anticarcinogen, Sulforaphane, Sulforaphane nitril, protein Epithiospecifier, Quinone reductase

Kesimpulannya, sulforaphane adalah fitokimia yang ditemukan dalam brokoli, dan sayuran silangan lainnya. Jumlah oksidan yang tidak terkontrol yang disebabkan oleh faktor internal dan eksternal dapat menyebabkan stres oksidatif dalam tubuh manusia yang pada akhirnya dapat menyebabkan berbagai masalah kesehatan. Sulforaphane dapat mengaktifkan produksi Nrf2, faktor transkripsi yang membantu mengatur mekanisme antioksidan pelindung yang mengontrol respons sel terhadap oksidan. Cakupan informasi kami terbatas pada masalah chiropraktik dan kesehatan tulang belakang. Untuk mendiskusikan materi pelajaran, jangan ragu untuk bertanya kepada Dr. Jimenez atau hubungi kami di�915-850-0900 .

Diundangkan oleh Dr. Alex Jimenez

Direferensikan dari: Sciencedirect.com

Topik Tambahan Diskusi: Acute Back Pain

Nyeri punggung adalah salah satu penyebab paling umum dari kecacatan dan hari-hari yang terlewat di tempat kerja di seluruh dunia. Nyeri punggung dikaitkan dengan alasan paling umum kedua untuk kunjungan kantor dokter, kalah jumlah hanya oleh infeksi saluran pernapasan atas. Sekitar 80 persen populasi akan mengalami sakit punggung setidaknya sekali sepanjang hidup mereka. Tulang belakang adalah struktur kompleks yang terdiri dari tulang, persendian, ligamen, dan otot, di antara jaringan lunak lainnya. Karena itu, cedera dan / atau kondisi yang semakin parah, seperti cakram hernia, akhirnya dapat menyebabkan gejala nyeri punggung. Cedera olahraga atau cedera kecelakaan mobil sering menjadi penyebab paling sering dari nyeri punggung, namun terkadang gerakan yang paling sederhana dapat memiliki hasil yang menyakitkan. Untungnya, pilihan pengobatan alternatif, seperti perawatan chiropractic, dapat membantu meringankan nyeri punggung melalui penggunaan penyesuaian tulang belakang dan manipulasi manual, yang pada akhirnya meningkatkan pereda nyeri.

EXTRA EXTRA | TOPIK PENTING: Direkomendasikan El Paso, TX Chiropractor

***